Vývoj NIPT ve světe a v České republice:
| 1997 | objev volně cirkulující DNA plodu, |
| 1997 | neinvazivní určení pohlaví plodu prostřednictvím detekce Y-chromozomových sekvencí, |
| 1998 | kvantitativní analýza volné fetální DNA v mateřské cirkulaci, |
| 1998 | neinvazivní určení RHD genotypu u plodu, |
| 1999 | prokázané rychlé odbourání volné fetální DNA po porodu, |
| 2000 | neinvazivní DNA test na monogenní dědičné onemocnění (achondroplazie), |
| 2008 | pilotní studie na neinvazivní stanovení aneuploidie plodu, |
| 2009 | první aplikace a potvrzení konceptu, že sekvenování nové generace (NGS) umožňuje detekci trizomie 21 plodu, |
| 2010 | detailně charakterizovaná rozdílnost fragmentace mateřské a fetální DNA, |
| 2010 | neinvazivně stanovená podrobná genomická mapa plodu, |
| 2011 | dostupnost komerčních testů NIPT, |
| 2012 | neinvazivně stanovená úplná genomická sekvence plodu, |
| 2013 | postupně nabízené NIPT testy odesílané k vyšetření do zahraničí, |
| 2015 | NIPT vyšetřované v laboratořích v České republice, |
| uvedení TRISOMY testu do klinické praxe |
Princip testu
Vyšetření využívá celogenomovou resekvenační analýzu cffDNA izolované z periferní krve těhotné. Data získaná resekvenační analýzou s nízkým pokrytím jsou vyhodnocována vlastním výpočetním algoritmem a verifikované podle postupu publikovaného Bianchi a kol. (2012). *
* Bianchi DW a kol. Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing. Obstet Gynecol. 2012 May; 119 (5):890 – 901.
Klinický význam
TRISOMY test se provádí za účelem zachycení nejčastějších trizomií u plodu s vysokou citlivostí a přesností a to již v raných stádiích těhotenství. Tento test tak pomáhá snižovat množství nutných invazivních odběrů (choriocentéza, amniocentéza),* v důsledku kterých je lehce zvýšené riziko potratu související s odběrem.
I přes velmi vysokou citlivost a přesnost záchytu sledovaných trizomií je TRISOMY test screeningové, ne diagnostické vyšetření.
V praxi to znamená, že každý pozitivní výsledek vyšetření TRISOMY testu musí být následně potvrzen invazivním odběrem genetického materiálu plodu (odběr plodové vody nebo choriových klků) a následným genetickým vyšetřením takto získaného vzorku (viz interference).
Negativní výsledek TRISOMY testu vyloučí přítomnost trizomií 21, 18 a 13 u plodu a to s neobvykle vysokou přesností. Negativní výsledek testu zpravidla není potřeba potvrzovat invazivním způsobem (viz interference).
* Bianchi DW a kol. Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing. Obstet Gynecol. 2012 May; 119 (5):890 – 901.
Ošetřující lékař
Vyšetření indikuje lékař se specializací gynekologie a porodnictví nebo klinický genetik.
Citlivost a přesnost
NIPT testy se všeobecně vyznačují vysokou citlivostí a přesností. Vyšetření cffDNA, poskytované různými laboratořemi, se liší určitými technickými detaily. S tím souvisí rozdíly v dosahovaných klíčových parametrech NIPT testů a to především:
- procento zachycených trizomických plodů – DetectionRate (DR)
- procento falešně pozitivních výsledků – False PositiveRate (FPR)
Citlivost NIPT na trizomii 21 a trizomii 18 se pohybuje podle konkrétní laboratoře a typu testu v rozmezí 94,4 – 100 % při 0 – 2,05 % falešně pozitivních výsledků.
Citlivost NIPT testů na trizomii 13 je nižší (79 – 92 %). Důvodem případného selhání NIPT mohou být technické příčiny a též velmi zřídkavý výskyt gravidit s trizomií 13 v populaci. Míru falešné pozitivity je možné očekávat na úrovni 1 – 2 %.
NIPT – detekce chromozomových
aneuploidií – spolehlivost
| Trial | Down syndrome | |
| DR (n (%)) | FPR (n (%) | |
| Chiu et al., 2011 | 86/86 (100) | 3/146 (2,1) |
| Ehrich et al., 2011 | 39/39 (100) | 1/410 (0,24) |
| Palomaki et al., 2011 | 209/212 (98,6) | 3/1471 (0,20) |
| Bianchi et al., 2012 | 89/90 (98,9) | 0/410 (0,00) |
| Sparks et al., 2012 | 36/36 (100) | 1/123 (0,81) |
| Ashoor et al., 2012 | 50/50 (100) | 0/297 (0,00) |
| Norton et al., 2012 | 81/81 (100) | 1/2888 (0,03) |
| Total | 590/594 (99,3) | 9/5745 (0,16) |
TRISOMY test –
citlivost a přesnost
| n = 203 | Citlivost | 95 % CI | Přesnost | 95 % CI | nP |
|---|---|---|---|---|---|
| T21 | > 99 % | 90,97-100 % | > 99 % | 97,78-100 % | 39 |
| T18 | > 99 % | * | > 99 % | * | 5 |
| T13 | > 99 % | * | > 99 % | * | 2 |
n – celkový počet vzorků v potvrzující studii
nP – počet pozitivních vzorků
CI – Confidence Interval
* 95 % CI pro nízký počet vzorků nehodnocený
Počet vzorků bez výsledku při NIPT: < 5 %.
Počet vzorků bez výsledku při TRISOMY testu: < 1 %.
Citlivost a přesnost TRISOMY testu jsou plně porovnatelné s výsledky jiných NIPT testů. Výsledek analýzy je založen na potvrzující studii a opírá se o analýzu kontrolních vzorků se známým karyotypem.
Všechny, do studie zařazené trizomické vzorky 21, 18 a 13, byly pomocí TRISOMY testu úspěšně detekovány.
Unikátní metodika přípravy vzorku krve
Speciální součástí laboratorního postupu při vyšetření TRISOMY testu je unikátní procedura, která umožňuje zvýšení podílu cffDNA oproti výchozímu stavu. Je to díky využití fyzikální odlišnosti cffDNA a cfDNA pocházející od matky. Díky tomuto kroku laboratoř dosahuje po zpracování vzorků TRISOMY testu přiměřený podíl fetální DNA 16 % (přiměřený podíl fetální DNA ve zveřejněných studiích se pohybuje v rozmezí 10 – 13 %). Ještě důležitější je však fakt, že v souboru vzorků zpracovaných touto speciální metodikou nebyl nikdy dosažen menší podíl fetální DNA plodu než 7,5 %, což výrazně snižuje riziko selhání testu z důvodu nízkého obsahu fetální frakce DNA ve vyšetřovaném vzorku.
Na základě charakteristiky metody přípravy, analýzy a hodnocení vzorků od těhotných se zdravým plodem a těhotných s plodem s trizomií chromozomu 21, použité v rámci naší potvrzovací studie, je možné statisticky odhadnout výskyt falešně pozitivních a falešně negativních výsledků v závislosti na podílu fetální DNA v krvi těhotné. V návaznosti na dostupné informace je známo, že výška podílu cffDNA v krvi těhotné je individuální a výskyt vzorků s nízkou fetální frakcí (< 4 %) byl zjištěn u méně než 5 % těhotných (přiměřený podíl cffDNA se pohybuje na úrovni 14,5 %).**
Z výsledků námi realizované potvrzovací studie, při které bylo analyzováno 164 vzorků od těhotných s plodem bez sledovaných trizomií a 39 vzorků od těhotných s plodem s potvrzenou trizomií chromozomu 21, vyplynulo, že přiměřený podíl fetální DNA ve vzorcích získaných od těhotných s plodem s trizomií chromozomu 21 dosahoval 16 % (modrá křivka nagrafu 1). Při tomto podílu fetální DNA v mateřské cirkulaci je pravděpodobnost, že výsledek analýzy bude neinformativní ~ 1:3×1013 a pravděpodobnost, že dosažený výsledek bude falešně negativní (tedy nesprávný) nižší než 1:9×1018.
Při vzorku s nejnižším, v naší studii pozorovaným, podílem cffDNA dosahujícím 7,5 % (červená křivka) je pravděpodobnost výskytu neinformativního výsledku ~ 1 : 15 a pravděpodobnost výskytu falešně negativního (tedy nesprávného) výsledku nižší než 1 : 740.
Z analýzy výsledků vzorků od těhotných se zdravým plodem (modrá křivka) vyplývá, že pravděpodobnost výskytu neinformativního výsledku je ~ 1 : 161 a pravděpodobnost výskytu falešně pozitivního (tedy nesprávného) výsledku je nižší než 1 : 30 000.
Na minimalizaci rizika získání falešně negativních, resp. falešně pozitivních výsledků v důsledku přirozeně se vyskytujících případů těhotenství s nízkou fetální frakcí, je při vyhodnocení výsledků analýz použita zóna definující neinformativní výsledky – tzv. šedá zóna. Ta je na grafu prezentována šedým podbarvením (graf 2). Pokud se vzorek po analýze nachází v této oblasti, je potřeba vzorek opětovně analyzovat. V této souvislosti se vyžaduje opakování odběru krve těhotné ve dvoutýdenním intervalu.
** Hudecova I, Sahota D, Heung MM, Jin Y, Lee WS, Leung TY, Lo YM, Chiu RW. Maternal plasma fetal DNA fractions in pregnancies with low and high risks for fetal chromosomal aneuploidies. PLoS One. 2014 Feb 28; 9 (2): e88484. doi: 10.1371/journal.pone.0088484
Vyhodnocení dat pomocí vlastního algoritmu
Data jednotlivých NIPT testů získaná celogenomovou resekvenační analýzou cffDNA jsou vyhodnocována pomocí náročných matematických modelů a liší se v závislosti na použité metodice laboratoře. Cílem hodnocení je výpočet tzv. Z-skóre (graf 4).
Vlastní zdokonalený algoritmus hodnocení dat TRISOMY testu umožňuje dosažení vyšší střední hodnoty Z-skórev hodnocených vzorcích proti konkurenčním metodám výpočtu.
Vyšší střední hodnota Z-skóre v pozitivních vzorcích, dosahovaná zdokonaleným algoritmem při hodnocení TRISOMY testu, se automaticky promítá do přesnější distribuce negativních a pozitivních hodnot výsledků vyšetření a umožňuje zmenšení tzv. šedé zóny (Area of Overlap), kdy není možné o pozitivitě či negativitě výsledku vyšetření jednoznačně rozhodnout.
Interference
Vzhledem k tomu, že TRISOMY test je screeningový a ne diagnostický test, mohou se vyskytnout falešně pozitivní a falešně negativní výsledky. Pozitivní výsledek analýzy je potřeba diagnosticky potvrdit aktuálně dostupnou diagnostickou metodou, tedy následným genetickým testem z odběru choriových klků nebo plodové vody.
Negativní výsledek není absolutním vyloučením žádné z testovaných trizomií. Příčinou může být přirozeně se vyskytující fenomén mozaicizmu placenty, syndromu mizejícího dvojčete, bodových mutací, inaktivace genů nebo jiných typů genetických, resp. epigenetických mechanizmů nebo přítomnost cizí DNA v krvi matky.
V určitém malém procentu vzorků není možné NIPT test ukončit jednoznačným výsledkem, takový test považujeme za neúspěšný.*** Příčina selhání může být technická nebo biologická. Hlavní technickou příčinou selhání testu bývá nesprávně vykonaný odběr krve nebo transport vzorku do laboratoře v nevyhovujících podmínkách.
Nejčastějším biologickým důvodem neúspěšnosti testu je především snížený podíl fetální DNA v získaném vzorku v porovnání s obsahem mateřské DNA. V případě, že je podíl fetální DNA v získaných vzorcích nižší než 4 %, výrazně klesá spolehlivost testu (graf 5). Podle výsledků publikovaných studií je možné očekávat výskyt vzorků s nízkým podílem fetální DNA frakce na úrovni 1,5 – 6,1 %.
Výsledky získané hodnocením vzorků s obsahem fetální DNA pod 4 % nejsou vhodné na interpretaci.
*** M. M. Gil, M. S. Quezada, R. Revello, R. Akolekar, and K. H. Nicolaides, „Analysis of cell-free DNA in maternal blood in screening for fetal aneuploidies: updated meta-analysis,“ Ultrasound Obstet. Gynecol. 45 (3), 249-266 (2015)